O teste de Coombs ou Teste da Antiglobulina Direto (TAD) é uma técnica laboratorial para determinar se os eritrócitos foram fixados in vivo (opsonizados) por imunoglobulinas, complemento, ou ambos.

É usado principalmente na investigação de:

• Reações transfusionais hemolíticas;
• Doença hemolítica do recém-nascido;
• Anemia hemolítica auto-imune;
• Hemólise induzida por drogas.

Os anticorpos ditos incompletos "imunes", quando em contato com hemácias que contenham o antígeno correspondente, fixam-se na membrana das mesmas, bloqueando o antígeno; não têm, entretanto, a capacidade de aglutinar estas hemácias.

O soro de Coombs (soro antiglobulina humana) é capaz de promover a aglutinação dessas hemácias, ditas sensibilizadas.

Tipo de amostra utilizada

Sangue total colhido com o anticoagulante EDTA (tampa roxa/lilás).

Reagentes necessários

• Reagente de antiglobulina humana (soro de Coombs) – antiglobulina poliespecífica, anti-IgG ou anti-complemento;
• Reagente controle negativo (salina ou albumina 6%);
• Reagente controle positivo (hemácias sensibilizadas com IgG ou complemento).

Técnica em tubo

1. Prepare uma suspensão salina (2 - 5%) das hemácias a serem testadas (paciente);
2. Lavagem:
   a) coloque 2 gotas (100 µL) desta suspensão em 1 tubo;
   b) adicione solução fisiológica até preencher 2/3 do tubo;
   c) centrifugue a 3000 r.p.m. por cerca de um minuto;
   d) despreze o sobrenadante com cuidado para deixar o “botão” de hemácias no fundo do tubo;
   e) repita esse passo mais duas vezes (total = 3 lavagens); na última vez, com auxílio de um papel de filtro/toalha, despreze toda a salina;
   f) quando se tratar de sangue umbilical, lave as hemácias no mínimo oito vezes;
3. Adicione 2 gotas (100 µL) do reagente de antiglobulina humana e homogeneize;
4. Centrifugue em rotação baixa (~1000 rpm) por 15 segundos;
5. Leitura:
   a) agitar levemente o tubo;
   b) observe se há aglutinação das hemácias;
   c) faça a semi-quantificação do resultado (0, +, ++, +++,++++).

Técnica em gel

1. Prepare uma suspensão de hemácias a 1%:
   a) Centrifugue o tubo com a amostra para sedimentar as hemácias;
   b) 1000 µL da solução de diluição (consulte a marca do kit);
   c) 10 µL das hemácias concentradas por centrifugação;
2. Pipete 50 µL da suspensão no microtubo do cartão específico para Coombs (consulte a marca do kit);
3. Centrifugue de acordo com as recomendações da marca do kit;
4. Realize a leitura e faça a semi-quantificação.

Interpretação 

Sem aglutinação visível = teste negativo.

Presença de aglutinação (+, ++,+++ e ++++) = teste positivo.

Notas importantes!

O teste inicial deve ser realizado utilizando-se o reagente poliespecífico. 

• Se o TAD for negativo com esse reagente, nenhum teste adicional é necessário. 
• Se o TAD for positivo com a antiglobulina poliespecífica, é necessário utilizar os reagentes monoespecíficos (anti-IgG e anti-complemento) para saber qual globulina está presente.

O TAD é positivo quando aglutinação é observada tanto imediatamente após a centrifugação quanto após a centrifugação seguida de incubação à temperatura ambiente.

Hemácias sensibilizadas por IgG geralmente reagem imediatamente, enquanto que as sensibilizadas pelo complemento podem ser melhor demonstradas após a incubação à temperatura ambiente.

Um TAD negativo não necessariamente significa que não há moléculas de globulinas fixadas nas hemácias. 

• Os reagentes antiglobulina poliespecífica e anti-IgG detectam de 150 a 500 moléculas de IgG por célula, mas alguns pacientes podem apresentar hemólise quando a sensibilização por IgG está abaixo desse nível.

Referências

Klein HG, Anstee DJ. Mollison’s blood transfusion in clinical medicine. 12th ed. Oxford: Wiley-Blackwell, 2014.

Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemia. Philadelphia: Churchill-Livingstone, 2004.

Leger RM. The positive direct antiglobulin test and immune-mediated hemolysis. In: Fung M, Grossman BJ, Hillyer CD, Westhoff CM, eds. Technical manual, 18th ed. Bethesda, MD: AABB, 2014:427-53.

A Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Campus de Araraquara-UNESP, torna pública a abertura de inscrições para o Processo Seletivo para o preenchimento de vagas do Programa de Aprimoramento Profissional na Área da Saúde – PAP e Curso de Especialização em Análises Clínicas e Hemoterapia, a serem oferecidas em 2018 para profissionais e estudantes que concluírem a graduação até dezembro de 2017.

Programa

Análises clínicas e hemoterapia.

Público alvo: farmacêuticos e biomédicos.

Duração: 1 ano (01/03/2018 a 28/02/2019).

Vagas, bolsa e carga horária

O número de vagas a serem oferecidas corresponde ao número de bolsas de estudo que será definido pela SES - SP e será publicado no Edital de Resultado Final e Convocação para a Matrícula.

A carga horária mínima prevista para cada programa de 1 (um) ano é de 1760 horas e para os programas de 2 (dois) anos é de 3520 horas, correspondendo a 40 horas semanais.

O valor bruto da bolsa de estudo é de R$ 1.044,70 por mês – ano base 2017, fixada pela SES - SP.

Durante o curso, o aprimorando não poderá ter vínculo empregatício com instituições que recebam recursos do Sistema Único de Saúde – SUS, devendo dedicar-se exclusivamente ao Programa de Aprimoramento Profissional – PAP e Curso de Especialização em Análises Clínicas e Hemoterapia, durante os 12 meses previstos para o mesmo.

Processo seletivo

O Processo Seletivo constará de duas fases:

• Primeira Fase - Prova Objetiva;
• Segunda Fase – Análise do Curriculum vitae (com Entrevista).

Inscrições

Até 18/01/2018.

Taxa: R$ 78,00.

Link para o edital

Antes tarde do que nunca - O ministro da Saúde, Alexandre Padilha, assinou no dia 12 de novembro, a portaria que torna obrigatória a realização do Teste de Ácido Nucleico (NAT) em todas as bolsas de sangue coletadas pelos bancos de sangue públicos e privados do país.

“Estamos adotando este teste como obrigatório tanto nos bancos de sangue públicos quanto nos privados. [O teste] já acontece em 100% dos bancos públicos brasileiros e agora nos permitir colocar nos bancos privados", disse Padilha.

A realização do teste NAT permite maior rapidez na identificação de vírus como o HIV e o da hepatite C no sangue de doadores. O exame reduz a janela imunológica para a identificação mais rápida desses vírus. A redução do tempo que o vírus permanece indetectável – a janela imunológica - por teste é de 35 dias para 12 dias no caso da hepatite C e de 22 dias para dez dias, no caso do HIV.

O NAT identifica o material genético do vírus e não os anticorpos como ocorre com o exame ELISA, normalmente utilizado nos bancos de sangue, o que permite um resultado mais rápido e eficaz.

O Sistema Único de Saúde (SUS) conta com 32 hemocentros coordenadores e 368 regionais, além de núcleos de hemoterapia distribuídos em todo o país. Atualmente, 75% da coleta de sangue são feitos na rede pública e 25%, na rede privada. Os bancos de sangue terão 90 dias para se adequar às novas regras. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) será responsável pela fiscalização das redes.

Para saber mais sobre o NAT

Com informações da Agência Brasil

Tudo começa em um Banco de Sangue com a doação, pois o serviço de hemoterapia é o local onde ocorre a coleta, o armazenamento, processamento, fracionamento e aplicação do sangue. O trabalho da Hemoterapia é regido por normas legais e técnicas cada vez mais rigorosas.

Os bancos de sangue procuram a maior semelhança possível do material doado através da compatibilização dos grupos sanguíneos. Outra parte, igualmente importante, é a qualidade sorológica (sorologia do sangue é a pesquisa através de exames laboratoriais de doenças passíveis de serem transmitidas pelo sangue).

O QUE O BIOMÉDICO PODE FAZER

Executar o processamento de sangue e suas sorologias

O sangue é submetido a vários processos após a coleta, incluindo teste para as principais doenças transmissíveis pelo sangue. Sendo obrigatório os testes de AIDS, Sífilis, HTLV 1 e 2, Hepatite B e C, Chagas e Malária em regiões endêmicas. O doador é avisado de seu resultado e orientado a realizar uma investigação mais detalhada em serviço de referência.

O sangue é separado em hemocomponentes para melhor atender às necessidades dos pacientes, transfundindo apenas o componente necessário em maior concentração e menor volume, evitando desperdício e valorizando ainda mais a doação.

A rotulagem ocorre após os resultados dos testes. As bolsas reprovadas são descartadas e as aprovadas são identificadas com: nome e endereço do Banco de Sangue, tipagem, fator RH, testes realizados, observações técnicas e identificação que permitam a rastreabilidade do doador. Após, as bolsas liberadas passam para o estoque ficando disponível para transfusão e distribuição aos hospitais conveniados conforme a necessidade e compatibilidade com cada paciente.

Realizar exames pré e pós-transfusionais

Antes da doação, o candidato irá passar por uma entrevista de triagem clínica, na qual podem ser detectadas algumas condições adicionais que possam impedir a doação. Após cada doação serão realizados os seguintes exames no sangue coletado:

• Tipagem sanguínea ABO e Rh;
• Pesquisa de anticorpos eritrocitários irregulares (PAI);
• Teste de Coombs Indireto;
• Fenotipagem do Sistema Rh Hr (D,C,E.c,e), Fenotipagem de outros sistemas;
• Testes sorológicos para: Hepatite B, Hepatite C, Doença de Chagas, Sífilis, HIV (AIDS), HTLV I/II.

Esse procedimento se repetirá após cada doação e os resultados serão comunicados ao doador.

Outras funções

Assumir chefias técnicas, assessorias e direção de unidades; Manusear equipamentos de auto-transfusão.

O Biomédico é profissional legalmente capacitado e habilitado para assumir o assessoramento e executar trabalhos específicos e relacionados ao processamento semi-industrial e industrial do sangue, correlatos, e realizar todos os procedimentos técnicos de banco de sangue, transfusão, infusão de sangue, hemocomponentes e hemoderivados; do mesmo modo, assumir chefias técnicas e assessorias destas atividades independentemente de seu nível de complexidade, devendo estar sob responsabilidade técnica de profissional médico, especialista em hemoterapia ou hematologia, ou qualificado por órgão competente devidamente.

Comparação entre as metodologias utilizadas em Banco de Sangue.

Janela imunológica na infecção pelo HCV com os marcadores utilizados.

Notícia: Novos testes de Bio-Manguinhos geram economia ao Ministério da Saúde
Dois novos produtos de Bio-Manguinhos ajudarão não só os brasileiros que utilizam a rede pública de saúde como também o próprio Ministério da Saúde (MS). Isso porque o teste confirmatório imunoblot rápido DPP® HIV-1/2 e o KIT NAT HIV/HCV reduzirão consideravelmente os altos gastos do governo com a importação desses produtos. A economia pode chegar a 80%.

O Ministério da Saúde (MS) incorporou o Teste de Ácido Nucleico (NAT) na triagem sorológica do doador de sangue do SUS. A medida foi publicada no Diário Oficial da União e passa valer em 180 dias.

Atualmente, o teste mais utilizado no país para controle de qualidade do sangue doado é o ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Ligado à Enzima), que detecta o HIV em aproximadamente 22 dias após a infecção e o HCV (vírus da hepatite C) em aproximadamente 70 dias.

Molécula de Hemoglobina

A cor vermelha do sangue é provocada pela presença dos eritrócitos que compõem cerca de 40-45% do volume total (hematócrito). Um eritrócito é constituído por 60% de água e 40% de parte sólida, sendo a maior proporção desta representada pelas moléculas de Hemoglobina.

Anticorpos naturais

O sistema ABO apresenta anticorpos naturais circulantes no plasma. 

Esses são chamados de iso-hemaglutininas (IgM) e reconhecem antígenos ABO. 

As iso-hemaglutininas foram identificadas por Landsteiner.

A presença dos anticorpos naturais começa a ser detectada a partir dos 3-6 meses de idade, atingindo o título máximo por volta dos 5 a 10 anos de vida e permanecendo desta forma até a fase adulta.

A produção dessas isoaglutininas é induzida por polissacarídeos provenientes de células bacterianas ou lectinas de vegetais e que são semelhantes aos antígenos do sistema ABO. 

Assim, o indivíduo do tipo A terá contato com antígenos dessas fontes exógenas (polissacarídeos ou lectina) semelhantes ao A e B, mas apenas produzirá anticorpos anti-B.

Essa resposta imune é do tipo T-independente.

Anticorpos imunes ou aloanticorpos

Pode existir a formação de anticorpos anti-A e anti-B do tipo IgG (imunes) em função de estímulos com substâncias grupo-específicas A ou B nas seguintes situações:

• Aloimunização por gravidez
• Aloimunização após transfusão sanguínea incompatível

Esses anticorpos não se apresentam de forma natural. 

Exemplos importantes:

• anti-D
• anti-C
• anti-E
• anti-c
• anti-K 
• anti-Fya
• anti-Jka
• anti-S

São chamados assim porque são formados em resposta a uma aloimunização, quando um indivíduo recebe hemácias com antígenos diferentes, por transfusão ou gestação, e seu organismo o reconhece como não-próprio. 

Geralmente os mais relevantes são IgG, reativos a 37 °C e detectáveis na fase de antiglobulina, embora existam exceções.

• Veja: Teste de Coombs Indireto

Anticorpos frios e quentes

• Anticorpos frios reagem melhor em temperaturas abaixo de 37 °C e muitas vezes têm menor relevância transfusional.
• Anticorpos quentes apresentam maior reatividade em torno de 37 °C e tendem a ter maior importância clínica.

Eles normalmente estão envolvidos em reação hemolítica transfusional, imediata ou tardia, e alguns também podem provocar anemia hemolítica do recém-nascido.

Um paciente com anti-K, por exemplo, não deve receber hemácias que expressem o antígeno K. 

A agência transfusional deve selecionar unidades compatíveis e negativas para o antígeno correspondente.

Importância na gestação

Na gestação, alguns anticorpos contra antígenos eritrocitários têm especial importância porque pertencem à classe IgG e conseguem atravessar a placenta. 

Quando o feto apresenta o antígeno correspondente, esses anticorpos maternos podem se ligar às hemácias fetais e promover sua destruição, levando à doença hemolítica do feto e do recém-nascido (DHFRN).

Entre os anticorpos de maior relevância estão anti-D, anti-c e anti-K. 

O anti-D é classicamente associado à isoimunização Rh, enquanto o anti-c também pode causar quadros importantes de hemólise fetal. 

O anti-K merece atenção especial porque, além da destruição das hemácias, pode comprometer a eritropoiese fetal, reduzindo a produção de células vermelhas.

Por esse motivo, a investigação de anticorpos eritrocitários irregulares durante o pré-natal é fundamental. 

Quando um anticorpo clinicamente significativo é identificado, a gestante deve ser acompanhada de acordo com sua especificidade, título e risco de o feto expressar o antígeno correspondente.

Anemia falciforme é uma doença hereditária caracterizada pela alteração dos glóbulos vermelhos do sangue, tornando-os parecidos com uma foice, daí o nome falciforme. Essas células têm sua membrana alterada e rompem-se mais facilmente, causando anemia. A hemoglobina, que transporta o oxigênio e dá a cor aos glóbulos vermelhos, é essencial para a saúde de todos os órgãos do corpo. Essa condição é mais comum em indivíduos da raça negra. No Brasil, representam cerca de 8% dos negros, mas devido à intensa miscigenação historicamente ocorrida no país, pode ser observada também em pessoas de raça branca ou parda.

Confira abaixo um vídeo bem didático e aprenda de vez o que acontece nessa doença.

A campanha nacional de incentivo à doação de sangue de 2011 tem como lema: Essa corrente precisa de você. Doe sangue.

Doar sangue é um ato de solidariedade. Quando uma pessoa precisa de sangue, precisa de mim, precisa de você, pois não há nada que substitua o sangue. Este é um pequeno gesto que pode salvar muitas vidas. Porque tem sempre alguém esperando sua doação.

Basta procurar o hemocentro mais próximo e se tornar um doador de sangue. Faça parte dessa corrente. Um grande ato apoiado e incentivado pelo sus. Participe. Doe sangue. É uma campanha do Ministério da Saúde e Governo Federal. Para mais informações acesse aqui.

O blog  apoia essa campanha!

Quando um soro/plasma de um paciente que contenha anticorpos incompletos for incubado, em uma temperatura específica, com hemácias que contenham o antígeno correspondente, os anticorpos fixam-se à superfície destas hemácias, sensibilizando-as. 

As hemácias sensibilizadas são reveladas pelo soro de Coombs (soro antiglobulina humana).

Através do teste de Coombs Indireto, pesquisa-se a presença de anticorpos incompletos ou imunes (irregulares) presentes na amostra do paciente.

Na hemoterapia (bancos de sangue e agências transfusionais) essa técnica é chamada de Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI).

• Leia também: Teste da Antiglobulina Direto (Coombs Direto)

Técnica em tubo

1. Preparar uma suspensão salina a 5% com hemácias conhecidas quanto ao antígeno e cujo anticorpo correspondente se deseja detectar (o mais comum é a detecção de anticorpos anti-Rh positivo, anti-D);
   a) As hemácias devem ser compatíveis com o soro quanto ao sistema ABO;
   b) Geralmente, empregam-se hemácias do grupo O, RhD positivo;
2. Colocar duas gotas (~100 µL) da suspensão em um tubo de ensaio e lavar três vezes com solução salina;
3. Adicionar duas gotas do soro (~100 µL) do paciente a ser testado;
4. Misturar e incubar a 37ºC, durante 30 a 45 minutos;
5. Em seguida, lavar as hemácias três vezes com solução salina e adicionar o soro antiglobulina humana (~100 µL);
6. Agitar e centrifugar a 1.000 rpm. por 15 segundos;
7. Proceder a leitura.

Técnica em gel

1. Pipete 50 µL da suspensão de hemácias comerciais I em um no microtubo do cartão específico para Coombs (consulte a marca do kit);
2. Pipete 50 µL da suspensão de hemácias comerciais II em outro microtubo do cartão específico para Coombs (consulte a marca do kit);
3. Pipete 25 µL do soro do paciente nos microtubos contendo as hemácias comerciais;
4. Coloque o cartão na incubadora a 37ºC por 30 minutos;
5. Após, centrifugue de acordo com as recomendações da marca do kit;
6. Realize a leitura.

Técnica em cartão de gel BioRad

Interpretação

Presença de aglutinação: Teste de Coombs Indireto Positivo
Ausência de aglutinação: Teste de Coombs Indireto Negativo

Observações

1. Utilize amostras-controle positivas e/ou negativas.
2. Nos casos positivos, é necessário fazer a titulação do soro. O título será dado pela última diluição com resultado positivo.
3. A pesquisa de anticorpos poderá ser feita em meio salino (sem emprego do soro de Coombs); em meio albuminoso (albumina) ou ainda utilizando-se hemácias previamente tratadas por enzimas (tripsina, etc).

Precauções

Tanto para as determinações do Fator RhD em tubo, provas de Coombs Direta e Indireta, é necessário que se tome uma série de cuidados.

• Não colocar hemácias em excesso na suspensão, pois poderá haver formação de um “botão” muito grande, levando eventualmente, a um resultado falsamente positivo.
• O tempo de incubação não deverá ser inferior a 30 minutos.
• A centrifugação final não deve exceder ao tempo e a velocidade preconizados, pois o “botão de hemácias” poderá aderir ao fundo do tubo, dificultando a leitura e podendo provocar um resultado falsamente positivo.

Referências

Girello AL, Kuhn TIBB. Fundamentos da imuno-hematologia eritrocitária. 3ª Ed.