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Fundamentos da citometria de fluxo para o diagnóstico laboratorial

terça-feira, abril 15, 2014 0 Comentários


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Imagem: The University of Chicago Medicine, Comprehensive Cancer Center

Texto por Dr. Leandro de Souza Thiago

Alguns contadores hematológicos automatizados de última geração usam a metodologia de citometria de fluxo (CMF) para identificar e quantificar células do sangue periférico. Esses aparelhos foram concebidos para gerarem resultados em larga escala e de forma independente do operador durante a fase analítica.

Enquanto os contadores hematológicos que usam CMF possuem corantes fluorescentes em seus equipamentos sem haver adição de reagentes previamente, os citômetros de fluxo propriamente ditos requerem a marcação prévia das amostras biológicas, que é feita, em geral, com a adição de anticorpos monoclonais fluorescentes. Como anticorpos são altamente específicos, a CMF permite identificar, quantificar e caracterizar, de forma extremamente específica, diversas populações celulares. Por usar anticorpos para determinação do fenótipo celular, essa metodologia é tradicionalmente denominada de imunofenotipagem por CMF.

De forma resumida, a CMF permite a análise de células individuais que passam em um fluxo laminar (como uma fila indiana) na frente de um ou mais lasers, gerando sinais luminosos que são captados pelos detectores e convertidos em sinais elétricos e estes, por sua vez, são transformados em dados eletrônicos para o computador.

Um citômetro é, em essência, um aparelho que capta luz que muda de direção e de cor. A mudança de direção da luz informa de maneira aproximada o tamanho da célula e a complexidade do seu citoplasma (se é granular ou não, por exemplo). A mudança de cor se deve ao fluorocromo acoplado ao anticorpo que foi adicionado. Cada fluorocromo é excitado em uma faixa de fluorescência e emite luz em outra faixa de cor. Por esse motivo, cada anticorpo do painel tem um único fluorocromo e este, por sua vez, não pode estar acoplado a nenhum outro anticorpo da mesma combinação utilizada.

FACSCANTO II
FACSCANTO II, capaz de ler 10 parâmetros celulares (8 fluorescências mais tamanho e complexidade) para cada célula individualmente.Fonte

Sendo um sistema aberto, podemos fazer análises pontuais com um pequeno número de anticorpos ou fazer um estudo minucioso da biologia das células de interesse com um amplo painel de anticorpos desejados. Há aparelhos que são capazes de identificar desde 3 moléculas marcadas até os ultra-modernos capazes de ler 20 cores (moléculas) ou mais.

Após as amostras serem adquiridas no citômetro (etapa analítica conhecida como aquisição e dependente de pessoal especializado), os dados gerados são analisados manualmente pelo imunologista ou hematologista laboratorial em um programa dedicado. Essa etapa pós-analítica demanda um elevado grau de especialização profissional para que o correto diagnóstico possa ser feito, já que é o especialista quem determinará através de seus próprios conhecimentos as anormalidades detectadas na amostra e fará a distinção entre células normais e patológicas.

Por ser uma tecnologia rápida (quando comparado aos métodos moleculares e de anatomia patológica), de alta sensibilidade e especificidade, a CMF é o método de escolha para o diagnóstico rápido de diversas entidades clínicas, tendo começado a ser amplamente utilizada na clínica em meados da década de 80 durante a pandemia da AIDS para avaliar os linfócitos T CD4 e CD8. Posteriormente, com os avanços científicos, a CMF passou a ter um papel essencial no diagnóstico de inúmeras patologias, tanto em doenças malignas (como leucemias e linfomas) como também em enfermidades não-neoplásicas.

O diagnóstico de doenças hematológicas através da imunofenotipagem por CMF é, sem dúvida, uma área de grande demanda reprimida no nosso País em que os biomédicos podem atuar firmando os laudos e assumindo a responsabilidade técnica, sempre que tenham adquirido uma sólida formação superespecializada na área.

Dr. Leandro de Souza Thiago é Biomédico, Doutor em Ciências Morfológicas pela UFRJ, com pós-doutorado em Imunologia pela Universidad de Salamanca (Espanha). É Tecnologista do Instituto Nacional de Câncer (INCa) e Membro Titular do Grupo Brasileiro de Citometria de Fluxo (GBCFLUX).

Brunno Câmara Biomédico

Biomédico, CRBM-GO 5596. Especialista em Hematologia e Hemoterapia pelo programa de Residência Multiprofissional do Hospital das Clínicas - UFG (HC-UFG). Criador e administrador do blog Biomedicina Padrão. Criador e integrante do podcast Biomedcast (biomedcast.com).