Para entender o que é, e como fazer uma diluição seriada, primeiramente temos que saber o que é uma diluição [simples].

Para fazer uma diluição simples é necessário combinar a amostra líquida de interesse com uma determinada quantidade de solvente, para chegar na concentração desejada.

O fator de diluição é o número total de unidades de volume em que seu material será dissolvido. A amostra diluída deve ser muito bem homogeneizada para alcançar a verdadeira diluição.

Por exemplo, se quiser fazer uma diluição de 1/5, ou 1:5 (leia-se: 1 para 5), você deve combinar 1 unidade de volume da amostra (material a ser diluído) mais 4 unidades de volume do solvente (água, NaCl 0,9%, etc.)

Diluição seriada

Uma diluição seriada é basicamente uma série de diluições simples que amplifica o fator de diluição. A fonte da amostra para diluição de cada etapa vem da diluição anterior.

Todas as diluições na série têm o mesmo fator de diluição, em que a amostra da diluição anterior é usada para fazer a diluição subsequente.

Por exemplo, se eu tiver uma diluição 1/2, meu fator de diluição é 2. Todas as diluições seguintes serão multiplicados por 2.

1/2 * 2 = 1/4 * 2 = 1/8 * 2 = 1/16 …

O objetivo desse tipo de diluição é ir diminuindo progressivamente a quantidade de soluto (amostra) em relação ao diluente.

Fórmulas

Nos cálculos a seguir, são utilizadas essas fórmulas:

• Volume transferido = Volume do diluente / (Fator de diluição -1);
• Volume total misturado = Volume do diluente + Volume transferido;

Como fazer

Exemplo: digamos que você quer fazer uma diluição começando com 1/2 para uma curva padrão com 7 pontos (a partir da amostra pura).

Isso que dizer que teremos 7 tubos identificados da seguinte forma: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128.

1. Determine o volume do diluente para cada etapa:

Suponhamos que vamos precisar de no mínimo 100 uL. Adicione um volume extra, por exemplo 20 uL, para compensar erros de pipetagem. Desse modo, colocaremos em cada tubo 120 uL de diluente.

2. Calcule o volume a ser transferido de um tubo para outro:

Volume transferido = 120 uL / (2-1) = 120 uL.

3. Calcule o volume total misturado:

Volume total misturado = 120 uL + 120 uL = 240 uL.

4. Prepare os tubos, colocando 120 uL de diluente em cada um.

5. Prepare a primeira diluição, que será de 1/2, com 120 uL de amostra mais 120 uL de diluente (que já está no tubo).

6. Transfira 120 uL do tubo 1 (diluição 1/2) para o segundo tubo e misture bem.

7. Faça o mesmo para todos os tubos seguintes.

8. Quando chegar no último tubo, retire 120 uL, para não ficar com 240 uL.

Se você tiver certeza que não irá precisar dos 120 uL restantes na pipeta, pode desprezá-los.

Caso você venha a precisar deles para dar continuidade na sua diluição seriada, guarde num tubo identificado.

Isso é importante pois você economiza tempo e não vai precisar começar do zero (da diluição de 1/2).

Aplicações

As diluições seriadas são muito utilizadas nas análises clínicas e em pesquisas científicas.

Em alguns exames com resultados positivos, como por exemplo VDRL, Coombs indireto, ASO, PCR e Fator Reumatoide (aglutinação em látex), a diluição seriada é utilizada para ver em qual diluição da série houve o último sinal de reatividade.

Por exemplo: tenho um resultado de VDRL positivo. Faço a diluição seriada e constato que a última reatividade ocorreu na diluição de 1/256. Esse é o resultado do exame, que a gente chama de título da reação.

VDRL
Resultado: Reagente (Título 1/256)
Valor de referência: Não reagente
Metodologia: Microfloculação

No caso de uma curva padrão para ELISA, também utilizamos a diluição seriada. Nesse caso não é observada a reatividade da reação, apenas diluímos o padrão para calibrar o aparelho.

Na microbiologia, a diluição seriada também é utilizada para diluir colônias de bactérias, por exemplo.