As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos (repique) de um meio de cultura ou material a ser analisado (ex.: secreções, alimentos etc.) para um outro meio de cultura. 

Para garantir que apenas o micro-organismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas.

Tipos de meio e insumos para a semeadura

Comumente, a semeadura é feita em tubos de ensaio ou em placas de Petri, utilizando-se meios líquidos (caldos), semissólidos ou sólidos (contendo ágar).

Porém, quando se precisa de grande quantidade de bactérias, é possível fazer cultivos em caldos, como o Caldo LB, em recipientes maiores, como erlenmeyers.

No meu mestrado e no instituto em que fui assistente de pesquisa em Montreal, Canadá, trabalhei com clonagem molecular. 

Em vários momentos, precisei fazer cultivos de E. coli em larga escala (250 e 500 mL) para posteriormente extrair uma grande quantidade de DNA plasmidial (midipreps e maxipreps).

Além de tubos e placas, são usados swabs, alças e agulhas de inoculação (bacteriológica).

É óbvio, mas não custa lembrar. Todos os meios e insumos utilizados devem estar estéreis, descartáveis ou flambáveis com bico de Bunsen.

Por que fazer semeadura em tubos?

Existem algumas utilidades em semear os inóculos em tubos:

• Fácil armazenamento em racks e estantes
• Titulação de bactérias 
• Fazer cultivos em meios líquidos
• Realizar provas bioquímicas para identificação

Em tubos, dependendo do objetivo, é possível fazer a semeadura em ágar inclinado ou não.

Por que fazer semeadura em placas de Petri?

Podemos citar como funções da semeadura em placas:

• Isolamento de colônias puras
• Quantificação de colônias
• Realização de provas de identificação e susceptibilidade

Semeaduras em meios sólidos em tubos

Estria sinuosa em ágar inclinado

Semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bisel (superfície inclinada do meio).

Objetivo: obtenção de intensa massa de micro-organismos.

Estria reta em ágar inclinado

Semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado para não ferir o ágar, partindo da base para a extremidade do bisel.

Objetivo: obtenção de pequena massa de micro-organismos.

Em ambos os casos, a semeadura é feita somente na superfície do ágar. Não ocorre perfuração do meio de cultura.

Essas técnicas são muito utilizadas para armazenar culturas puras por um período razoável de tempo, pois os tubos fechados perdem menos umidade e a exposição ao ar é muito pequena.

Picada em ágar inclinado

Semear com agulha bacteriológica, no centro do ágar e, ao chegar na superfície inclinada, fazer uma estria sinuosa (zig-zag).

Dependendo da finalidade, a agulha deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.

Objetivo: verificar fermentação e motilidade em algumas provas de identificação bacteriana.

É possível analisar o metabolismo aeróbico e anaeróbico de micro-organismos.

Picada em profundidade

Semear com agulha bacteriológica, no centro do ágar. 

Dependendo da finalidade, o inóculo deve ser inserido até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.

Objetivo: verificar fermentação e motilidade em algumas provas de identificação bacteriana, principalmente de micro-organismos com metabolismo anaeróbio.

Semeadura em meios líquidos (caldos)

Difusão

Fazer o repique da cultura em estudo (colônias ou caldo) para o caldo que será inoculado, usando alça bacteriológica ou pipetando o caldo incubado anteriormente.

Agitar a alça para maior difusão dos micro-organismos. 

Dependendo do objetivo e da bactéria estudada, pode ser necessário a incubação da cultura em incubadora com agitador orbital (shaker incubator), por exemplo 250 rpm a 37ºC.

Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido. 

O grau de crescimento pode ser verificado pela turbidez do meio.

Semeaduras em meios sólidos em placas de Petri

Pour plate ou disseminação (método em profundidade)

Transferir 1 mL da cultura para placa de Petri vazia, colocar 20 mL do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares.

Uma variação dessa técnica é misturar a cultura com o meio fundido que já foi autoclavado em frasco e volume ideais, homogeneizar e depois transferir a mistura para a placa.

Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de micro-organismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira camada.

Estria simples

Fazer o repique da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. 

A estria pode ser realizada em movimento de zig-zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). 

Objetivo: visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue etc.) e produção de pigmentos.

Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas

Fazer o repique da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. 

A placa é dividida em 4 quadrantes ("imaginários") e a inoculação pode ser feita de dois tipos:

Três estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante.

Quatro estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.

Objetivo: obtenção de colônias isoladas. 

É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. 

Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria.

Spread plate ou distensão

Transferir 0,1 mL da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente por toda a placa.

O espalhamento pode ser feito com alça bacteriológica, com swab ou com alça de Drigalski, dependendo do objetivo.

Objetivo: obtenção de crescimento confluente ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de teste de susceptibilidade antimicrobiana ("antibiograma").

Referências

David R. Caprette. Preparing and using agar slant tubes. Laboratory Studies in Microbiology. Rice University.

Kathryn Wise. Preparing Spread Plates Protocols. American Society for Microbiology.

Nazzy Pakpour e Sharon Horgan. Lab 2: Aseptic Technique. General Microbiology Lab Manual. California State University.

Joan Petersen e Susan McLaughlin. Introduction to Aseptic Techniques and Growth Media. Laboratory Exercises in Microbiology. Queensborough Community College.

Aloysio de Mello e Raquel de Souza. Apostila de Aulas Práticas – Bacteriologia. UFF 2007.