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A técnica mais comumente utilizada para o isolamento de células mononucleares (como linfócitos e monócitos) do sangue periférico, utiliza a centrifugação e um meio gradiente de densidade, chamado Ficoll-Paque.
O Ficoll é um polímero sintético de sacarose e epicloridrina com alto peso molecular solúvel em água.

As moléculas de Ficoll são altamente ramificadas, aproximadamente esféricas e compactadas, com um raio de aproximadamente 10 nm.

Técnica

A técnica é bastante simples.

Após a coleta de sangue anticoagulado, é necessário fazer uma diluição com uma solução tampão, como o Tampão fosfato-salina (PBS, Phosphate-buffered saline).

Em um tubo, o Ficoll é adicionado primeiramente e, então, o sangue diluído é adicionado logo em seguida.

A próxima etapa é centrifugar o material por 30 a 40 minutos (sem frenagem).

Resultado após a centrifugação

A migração diferencial das células durante a centrifugação resulta na formação de camadas contendo diferentes tipos de células:

• Camada inferior (fundo do tubo): contém eritrócitos, que sedimentam-se por completo;
• Camada imediatamente acima dos eritrócitos: contém a maior parte dos granulócitos, que atravessam o Ficoll devido a pressão osmótica do meio;
• Camada de Ficoll: fica acima da camada onde encontram-se os granulócitos;
• Camada de células mononucleares: fica imediatamente acima da camada de Ficoll, e também contém outras partículas que sedimentam-se devagar, como as plaquetas;
• Camada superior: contém o plasma sanguíneo.

Recuperando as células mononucleares

É necessário remover o plasma que forma a camada superior no tubo.

Após, as células mononucleares são transferidas para um novo tubo e uma lavagem com solução tampão é feita.

Para remover as plaquetas, após a lavagem, é necessário realizar mais uma centrifugação a 200xg e remover o sobrenadante (nessa velocidade as plaquetas ficam no sobrenadante).

Após o isolamento das PBMCs, você pode prosseguir com os experimentos subsequentes.

Referência

GE Healthcare. Isolation of mononuclear cells: methodology and applications. 2014.