Como isolar células mononucleares do sangue periférico

Por Brunno Câmara - quinta-feira, fevereiro 20, 2020



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A técnica mais comumente utilizada para o isolamento de células mononucleares (como linfócitos e monócitos) do sangue periférico, utiliza a centrifugação e um meio gradiente de densidade, chamado Ficoll-Paque.
O Ficoll é um polímero sintético de sacarose e epicloridrina com alto peso molecular solúvel em água.

As moléculas de Ficoll são altamente ramificadas, aproximadamente esféricas e compactadas, com um raio de aproximadamente 10 nm.

Técnica

A técnica é bastante simples.

Após a coleta de sangue anticoagulado, é necessário fazer uma diluição com uma solução tampão, como o Tampão fosfato-salina (PBS, Phosphate-buffered saline).

Em um tubo, o Ficoll é adicionado primeiramente e, então, o sangue diluído é adicionado logo em seguida.

A próxima etapa é centrifugar o material por 30 a 40 minutos (sem frenagem).

Resultado após a centrifugação

A migração diferencial das células durante a centrifugação resulta na formação de camadas contendo diferentes tipos de células:

  • Camada inferior (fundo do tubo): contém eritrócitos, que sedimentam-se por completo;
  • Camada imediatamente acima dos eritrócitos: contém a maior parte dos granulócitos, que atravessam o Ficoll devido a pressão osmótica do meio;
  • Camada de Ficoll: fica acima da camada onde encontram-se os granulócitos;
  • Camada de células mononucleares: fica imediatamente acima da camada de Ficoll, e também contém outras partículas que sedimentam-se devagar, como as plaquetas;
  • Camada superior: contém o plasma sanguíneo.


Recuperando as células mononucleares

É necessário remover o plasma que forma a camada superior no tubo.

Após, as células mononucleares são transferidas para um novo tubo e uma lavagem com solução tampão é feita.

Para remover as plaquetas, após a lavagem, é necessário realizar mais uma centrifugação a 200xg e remover o sobrenadante (nessa velocidade as plaquetas ficam no sobrenadante).

Após o isolamento das PBMCs, você pode prosseguir com os experimentos subsequentes.

Referência

GE Healthcare. Isolation of mononuclear cells: methodology and applications. 2014.

Brunno Câmara Autor

Brunno Câmara - Biomédico, CRBM-GO 5596, habilitado em patologia clínica e hematologia. Docente do Ensino Superior. Especialista em Hematologia e Hemoterapia pelo programa de Residência Multiprofissional do Hospital das Clínicas - UFG (HC-UFG). Mestre em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro (área de concentração: virologia). Coordenador e docente do curso de pós-graduação em Hematologia e Hemoterapia da AGD Cursos. Criador e administrador do blog Biomedicina Padrão. Criador e integrante do podcast Biomedcast.
| Contato: @brunnocamara |