Como isolar células mononucleares do sangue periférico
Por Brunno Câmara - quinta-feira, fevereiro 20, 2020
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A técnica mais comumente utilizada para o isolamento de células mononucleares (como linfócitos e monócitos) do sangue periférico, utiliza a centrifugação e um meio gradiente de densidade, chamado Ficoll-Paque.
O Ficoll é um polímero sintético de sacarose e epicloridrina com alto peso molecular solúvel em água.
As moléculas de Ficoll são altamente ramificadas, aproximadamente esféricas e compactadas, com um raio de aproximadamente 10 nm.
Técnica
A técnica é bastante simples.Após a coleta de sangue anticoagulado, é necessário fazer uma diluição com uma solução tampão, como o Tampão fosfato-salina (PBS, Phosphate-buffered saline).
Em um tubo, o Ficoll é adicionado primeiramente e, então, o sangue diluído é adicionado logo em seguida.
A próxima etapa é centrifugar o material por 30 a 40 minutos (sem frenagem).
Resultado após a centrifugação
A migração diferencial das células durante a centrifugação resulta na formação de camadas contendo diferentes tipos de células:- Camada inferior (fundo do tubo): contém eritrócitos, que sedimentam-se por completo;
- Camada imediatamente acima dos eritrócitos: contém a maior parte dos granulócitos, que atravessam o Ficoll devido a pressão osmótica do meio;
- Camada de Ficoll: fica acima da camada onde encontram-se os granulócitos;
- Camada de células mononucleares: fica imediatamente acima da camada de Ficoll, e também contém outras partículas que sedimentam-se devagar, como as plaquetas;
- Camada superior: contém o plasma sanguíneo.
Recuperando as células mononucleares
É necessário remover o plasma que forma a camada superior no tubo.Após, as células mononucleares são transferidas para um novo tubo e uma lavagem com solução tampão é feita.
Para remover as plaquetas, após a lavagem, é necessário realizar mais uma centrifugação a 200xg e remover o sobrenadante (nessa velocidade as plaquetas ficam no sobrenadante).
Após o isolamento das PBMCs, você pode prosseguir com os experimentos subsequentes.