A LAMP é uma técnica de biologia molecular desenvolvida nos anos 2000 para a amplificação de DNA. Desde então, passou por várias adaptações.

A RT-LAMP, combinação da RT com a LAMP,  pode ser usada na detecção de vírus cujo material genético seja o RNA.

É um método rápido, preciso, sensível e mais barato que uma PCR. Porém, tem suas limitações.

Antes de saber como ela é feita, vamos entender o nome.

O que significa RT-LAMP

RT vem de transcrição reversa. Esse processo é realizado por uma enzima transcriptase reversa, que produz DNA complementar (cDNA) a partir de moléculas de RNA.

A abreviação LAMP significa amplificação isotérmica mediada por loop (do inglês, Loop-mediated Isothermal Amplification).

• Amplificação: a enzima polimerase de alta eficiência amplifica a pequena quantidade de DNA alvo presente na amostra, gerando milhões de cópias da sequência.
• Isotérmica: a reação acontece numa única temperatura, geralmente entre 63 e 67°C.
• Mediada por loop: refere-se às estruturas em loop formadas no processo de amplificação, devido ao uso de primers específicos.

Mas, Brunno, se a LAMP amplifica DNA como ela pode ser usada na detecção de vírus de RNA?

É por isso que a transcrição reversa (RT) é feita, meu jovem.

Antes da amplificação, o cDNA é gerado e então a enzima DNA polimerase pode amplificá-lo.

Principais componentes da RT-LAMP

Amostra do paciente com suspeita de uma infecção por vírus de RNA, como por exemplo o SARS-CoV-2.

2 ou 3 pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para a sequência de interesse, senso e antisenso.

Enzimas transcriptase reversa e Bst DNA polimerase com atividade de helicase (da bactéria Geobacillus stearothermophilus).

Equipamento de temperatura, como termobloco, termociclador ou banho-maria.

Fotômetro para a leitura do resultado da reação.

Como a RT-LAMP funciona

Extração da amostra

O primeiro passo é fazer a extração do material genético que está sendo pesquisado presente na amostra do paciente.

A lise das células, para expor o genoma viral, pode ser feita por reagentes químicos ou por calor, ou uma mistura dos dois.

Esse processo dura cerca de 15 minutos.

Transcrição reversa

Para que a amplificação ocorra, a enzima transcriptase reversa deve converter a fita de RNA em fita simples de cDNA.

Amplificação

Geralmente ocorre entre 60 e 65°C, demora de 30 a 40 minutos e pode ser dividida em três etapas.

1- Produção inicial do alvo

São produzidas as primeiras sequências de DNA com as estruturas em loop nas extremidades.

Isso ocorre por meio do anelamento dos primers FIB (forward inner primer) e BIP (backward inner primer) e F3 e B3 que vão guiar a DNA polimerase.

Como não há etapa de desnaturação da fita de DNA a 95°C, como ocorre na PCR, os primers F3 e B3 fazem esse papel guiando a DNA polimerase que também tem a atividade de deslocamento de fita.

2- Ciclagem e amplificação

Os primers anelam-se novamente nas regiões específicas das sequências de DNA em loop já produzidas anteriormente.

Aqui, os primers F3 e B3 já não são mais necessários.

3- Elongação e reciclagem

As sequências de DNA alvo vão ficando ligadas umas às outras.

Isso forma estruturas maiores, longas e complexas, de tamanhos variados devido aos loops.

Detecção do produto

A leitura do resultado pode ser feita por:

• Turbidimetria - turbidez pelo acúmulo de pirofosfato
• Colorimetria - detecção de mudança de cor devido à adição de indicadores de pH, como o vermelho de fenol.
• Fluorescência - uso de agentes fluorescentes intercalantes de DNA, como o SYBR Green.

Essa leitura pode ser qualitativa (positiva ou negativa) ou ser quantitativa (fazendo curva padrão).

Referências

Mori Y, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J Infect Chemother. 2009;15(2):62-69. doi:10.1007/s10156-009-0669-9

Universo da Biologia Molecular. LAMP: Loop-mediated isothermal amplification (link).

Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63. doi:10.1093/nar/28.12.e63

Habibzadeh P, Mofatteh M, Silawi M, Ghavami S, Faghihi MA. Molecular diagnostic assays for COVID-19: an overview. Crit Rev Clin Lab Sci. 2021;58(6):385-398. doi:10.1080/10408363.2021.1884640