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Este guia tem como objetivo apresentar todas as informações importantes que irão te ajudar a escolher o frasco de cultivo celular ideal para seu laboratório.

Características essenciais de um frasco de cultivo celular

Esterilidade

O frasco de cultivo celular deve ser estéril.

A esterilização do frasco geralmente é feita por radiação gama, óxido de etileno ou irradiação com feixes de elétrons (E-beam).

A radiação gama é uma uma radiação ionizante de alta energia que penetra nos materiais e danifica o DNA dos micro-organismos. Essa radiação causa quebras na fita de DNA, levando à morte celular. Já o óxido de etileno é um gás que atua como agente alquilante, penetrando nas células e danificando várias estruturas, principalmente o DNA.

Usando o E-beam, elétrons de alta energia penetram no frasco e destroem moléculas de DNA e RNA de qualquer micro-organismo que esteja presente, como vírus, bactérias, fungos e outros potenciais contaminantes.

Pirógenos

Um frasco de cultivo celular deve ser apirogênico (livre de pirógenos).

Os pirógenos são substâncias que podem desencadear uma resposta inflamatória no corpo, mesmo em concentrações muito baixas.

Mesmo a existência de vestígios de pirógenos num frasco de cultivo celular pode danificar ou ativar suas células, levando a problemas com os resultados.

Enzimas

O frasco de cultivo celular também deve ser livre de enzimas DNases e RNases.

Essas enzimas degradam os ácidos nucleicos e sua presença na cultura de células pode impactar significativamente seus experimentos, principalmente aqueles envolvendo análises de ácidos nucleicos.

Estrutura e composição de um frasco de cultivo celular

Hoje em dia, os melhores frascos de cultivo celular são fabricados em poliestireno de grau médico (PS-GM) que possui maior pureza e biocompatibilidade, além de sua produção ser submetida a rígidas normas reguladoras, como a ISO 13485 e 10993.

O PS-GM tem como características a alta transparência, resistência a impactos e substâncias químicas e compatibilidade com vários métodos de esterilização sem sofrer degradação.

A alta transparência é essencial para uma visualização adequada da cultura, tanto a olho nu quanto ao microscópio.

Geralmente, o frasco tem uma graduação escrita de forma clara - em mililitros (mL) - em suas laterais para não atrapalhar a visualização. Além disso, tem uma área fosca para escrita de informações.

O gargalo inclinado do frasco de cultivo é projetado para aumentar a segurança e facilitar o acesso na hora de pipetar os líquidos e manipular as células. 

Esse tipo de gargalo é importante também para reduzir a evaporação, ajudar na ergonomia e na troca de gases e minimizar o risco de derramamento e contaminações.

Geralmente, o corpo do frasco de cultivo celular é plano (vertical e horizontal), o que ajuda na hora do seu manuseio e também na organização dentro da incubadora.

Por fim, o frasco é fechado com uma tampa. Veremos mais detalhes sobre ela a seguir.

Tipos de tampa para frasco de cultivo celular

A tampa do frasco de cultivo celular pode ser totalmente fechada e sem filtro (sealed cap) ou possuir ventilação com filtro (vent cap).

Tampa com filtro

Esse tipo de tampa contém uma membrana hidrofóbica (filtro) com poros de 0,22 micrômetros.

Esse filtro permite a troca de gases enquanto previne a evaporação de líquido e a contaminação da cultura.

Desse modo, os gases - como O2 e CO2 - conseguem se difundir enquanto são mantidas as condições atmosféricas adequadas dentro do frasco.

Esse tipo de tampa é ideal para a maioria das culturas de células aderentes em incubadoras com CO2 ambiente. Também funciona bem para culturas de células em suspensão e culturas de longo prazo.

Pode não ser aplicável em cultivos altamente sensíveis ou experimentos que precisem de um controle preciso do ambiente interno.

Tampa sem filtro

Esse tipo de tampa é totalmente fechada, sem membrana e ventilação. Isso cria um ambiente totalmente selado.

A troca de gases entre o ambiente e o frasco é minimizada, o que é importante para manter uma atmosfera interna específica, quando usadas, por exemplo, incubadoras com controle dos níveis de CO2.

A tampa sem filtro é adequada para culturas sensíveis à contaminação ou que precisem de um maior controle da composição de gases, como cultivos anaeróbicos.

É usada também em culturas de curto prazo em que a evaporação mínima é desejada.

Como a troca de gás é limitada, não é ideal para cultivos de longo prazo ou aqueles que precisem de reposição de CO2.

Área de crescimento vs. volume do frasco de cultivo celular

Tradicionalmente, os frascos de cultivo celular recebem uma nomenclatura de acordo com a área disponível para as células crescerem.

Podemos encontrar frascos como T25, T75, T175 e T225, em que o T vem de área total e o número corresponde ao valor dessa área em cm².

Ou seja, um frasco de cultivo celular T75 possui uma área total de crescimento celular de 75 cm².

Além do tamanho da superfície disponível para as células crescerem, os fabricantes indicam e recomendam qual o volume (em mL) de meio de cultura ideal para cada tamanho de frasco.

Então, mesmo que um frasco T75 tenha a capacidade para 250 mL de meio, o recomendado é que seja usado no cultivo um volume entre 15 e 22,5 mL.

Seguir essa recomendação é importante pois para um crescimento celular ótimo é necessário um equilíbrio entre a área de crescimento e volume do meio.

Se o frasco fosse preenchido completamente com o meio não sobraria espaço para as trocas gasosas e para a remoção dos produtos do metabolismo celular, além de que a troca de nutrientes não seria adequada.

Se você precisa de um volume diferente, comece com o que é recomendado pelo fabricante e vá ajustando aos poucos de acordo com sua necessidade e tipo celular.

Frasco de cultivo celular tratado e não tratado

Na hora da seleção do frasco de cultivo para seu laboratório é importante saber se você irá precisar que ele seja tratado ou não tratado.

A primeira etapa é conhecer as células com as quais você irá trabalhar. Elas podem precisar crescer aderidas à superfície do frasco ou crescer em suspensão.

Frasco tratado e células aderentes

Para células aderentes você irá usar os frascos de cultivo celular que são tratados.

Geralmente, os frascos são tratados em um processo chamado tratamento de plasma por vácuo.

Nesse tratamento um gás específico - O2 ou composto de silano - é introduzido numa câmara em baixa pressão; uma corrente elétrica excita as moléculas do gás criando um plasma.

O plasma de alta energia bombardeia a superfície do frasco, quebrando ligações e ativando grupos funcionais.

No caso do tratamento com silano, o grupo silanol (-SiOH) é introduzido na superfície, fornecendo cargas positivas que promovem a adesão celular.

A superfície pode ser tratada também com poli-L-lisina (polímero do aminoácido lisina) que também deixa a superfície do frasco carregada positivamente.

O tratamento promove uma forte adesão das células, que crescem ancorando-se na superfície e formando monocamadas confluentes.

Exemplos de células aderentes são fibroblastos, células epiteliais e muitas linhagens de células de câncer.

Essas células são usadas em vários tipos de estudo como os de proliferação, diferenciação e análise expressão gênica.

Frasco não tratado e células em suspensão

Os frascos de cultivo celular não tratados permanecem como foram fabricados, com uma leve carga negativa.

Com isso, a adesão celular é minimizada fazendo desse tipo de frasco ideal para cultivos de células em suspensão, que crescem livremente suspensas no meio.

Exemplos de células em suspensão são células sanguíneas, células-tronco e algumas linhagens de células tumorais, como as células HEL.

Agradecimento

Agradeço imensamente a Perfecta pela disponibilização do material para a elaboração deste artigo. Você encontra este e outros materiais consumíveis para laboratórios no site deles. Conheça mais sobre a empresa no Instagram e LinkedIn.

Referências

Perfecta. Frasco para cultivo celular.

Ian Freshney. Cell Culture Techniques: A Practical Guide. 5th Edition. Academic Press, 2023.

Weiskirchen, S., Schröder, S. K., Buhl, E. M., & Weiskirchen, R. (2023). A Beginner's Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells, 12(5), 682. 

Shinde A, Illath K, Gupta P, Shinde P, Lim K-T, Nagai M, Santra TS. A Review of Single-Cell Adhesion Force Kinetics and Applications. Cells. 2021; 10(3):577.