Teste da Antiglobulina Direto (Coombs direto)
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O teste de Coombs ou Teste da Antiglobulina Direto (TAD) é uma técnica laboratorial para determinar se os eritrócitos foram fixados in vivo (opsonizados) por imunoglobulinas, complemento, ou ambos.
É usado principalmente na investigação de:
- Reações transfusionais hemolíticas;
- Doença hemolítica do recém-nascido;
- Anemia hemolítica auto-imune;
- Hemólise induzida por drogas.
Os anticorpos ditos incompletos ‘imunes”, quando em contato com hemácias que contenham o antígeno correspondente, fixam-se na membrana das mesmas, bloqueando o antígeno; não têm, entretanto, a capacidade de aglutinar estas hemácias.
O soro de Coombs (soro antiglobulina humana) é capaz de promover a aglutinação dessas hemácias, ditas sensibilizadas.
Tipo de amostra utilizada
Sangue total colhido com o anticoagulante EDTA (tampa roxa/lilás).
Reagentes necessários
- Reagente de antiglobulina humana (soro de Coombs) – antiglobulina poliespecífica, anti-IgG ou anti-complemento;
- Reagente controle negativo (salina ou albumina 6%);
- Reagente controle positivo (hemácias sensibilizadas com IgG ou complemento).
Técnica em tubo
- Prepare uma suspensão salina (2 - 5%) das hemácias a serem testadas (paciente);
- Lavagem:
a) coloque 2 gotas (100 µL) desta suspensão em 1 tubo;
b) adicione solução fisiológica até preencher 2/3 do tubo;
c) centrifugue a 3000 r.p.m. por cerca de um minuto;
d) despreze o sobrenadante com cuidado para deixar o “botão” de hemácias no fundo do tubo;
e) repita esse passo mais duas vezes (total = 3 lavagens); na última vez, com auxílio de um papel de filtro/toalha, despreze toda a salina;
f) quando se tratar de sangue umbilical, lave as hemácias no mínimo oito vezes; - Adicione 2 gotas (100 µL) do reagente de antiglobulina humana e homogeneize;
- Centrifugue em rotação baixa (~1000 r.p.m) por 15 segundos;
- Leitura:
a) agitar levemente o tubo;
b) observe se há aglutinação das hemácias;
c) faça a semi-quantificação do resultado (0, +, ++, +++).
Técnica em gel
- Prepare uma suspensão de hemácias a 1%:
a) Centrifugue o tubo com a amostra para sedimentar as hemácias;
b) 1000 µL da solução de diluição (consulte a marca do kit);
c) 10 µL das hemácias concentradas por centrifugação; - Pipete 50 µL da suspensão no microtubo do cartão específico para Coombs (consulte a marca do kit);
- Centrifugue de acordo com as recomendações da marca do kit;
- Realize a leitura e faça a semi-quantificação.
Interpretação
Sem aglutinação visível = teste negativo.
Presença de aglutinação (+, ++ e +++) = teste positivo.
Notas importantes!
- O teste inicial deve ser realizado utilizando-se o reagente poliespecífico. Se o TAD for negativo com esse reagente, nenhum teste adicional é necessário. Se o TAD for positivo com a antiglobulina poliespecífica, é necessário utilizar os reagentes monoespecíficos (anti-IgG e anti-complemento) para saber qual globulina está presente.
- O TAD é positivo quando aglutinação é observada tanto imediatamente após a centrifugação quanto após a centrifugação seguida de incubação à temperatura ambiente;
- Hemácias sensibilizadas por IgG geralmente reagem imediatamente, enquanto que as sensibilizadas pelo complemento podem ser melhor demonstradas após a incubação à temperatura ambiente;
- Um TAD negativo não necessariamente significa que não há moléculas de globulinas fixadas nas hemácias. Os reagentes antiglobulina poliespecífica e anti-IgG detectam de 150 a 500 moléculas de IgG por célula, mas alguns pacientes podem apresentar hemólise quando a sensibilização por IgG está abaixo desse nível.
Referências
1. Klein HG, Anstee DJ. Mollison’s blood transfusion in clinical medicine. 12th ed. Oxford: Wiley-Blackwell, 2014.
2. Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemia. Philadelphia: Churchill-Livingstone, 2004.
3. Leger RM. The positive direct antiglobulin test and immune-mediated hemolysis. In: Fung M, Grossman BJ, Hillyer CD, Westhoff CM, eds. Technical manual, 18th ed. Bethesda, MD: AABB, 2014:427-53.