Diferença entre PCR e Nested PCR

Por Brunno Câmara - terça-feira, janeiro 09, 2018


Precisando de conteúdo para complementar seus estudos?
Conheça os Kits de Estudo Biomedicina Padrão: biomedicinapadrao.com.br/kits


PCR E NESTED PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método altamente sensível para a detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos e revolucionou a ciência.

Para que haja a amplificação são necessários oligonucleotídeos, pequenas sequências com cerca de 20 nucleotídeos (iniciadores ou primers), que irão se ligar na sequência de DNA alvo e fazer com que a enzima polimerase comece a adicionar os nucleotídeos complementares à fita da molécula.

A seleção dos primers é fundamental, já que eles definirão qual a sequência a ser amplificada. Eles podem ser desenhados para amplificar uma região do DNA única e específica ou para detectar um grupo comum de alvos, como por exemplo vírus relacionados, por meio da seleção de primers para uma região conservada.

Geralmente, são necessários um par de primers, denominados senso (forward) e antisenso (reverse). Um se ligará na fita no sentido 5’-3’ e outro no sentido 3’-5’.

PCR 1

Uma enzima DNA polimerase resistente a altas temperaturas (Taq) sintetiza a nova fita de DNA usando como molde a sequência entre os dois primers.

O ciclo de amplificação é repetido cerca de 20 a 40 vezes, e durante cada ciclo o DNA sintetizado no ciclo anterior também serve como molde. Dentro de algumas horas há um aumento exponencial na quantidade de DNA alvo (cerca de um milhão a um bilhão de cópias).

Para visualizar o resultado da PCR é necessário realizar uma eletroforese em gel, geralmente de agarose. Uma banda no gel do tamanho esperado é a evidência de que a reação é positiva.

Nested PCR

O princípio da Nested PCR é o mesmo da PCR convencional, o que vai diferenciar é a origem da amostra contendo o material genético que você irá utilizar na reação.

Na nested PCR, ao invés de se usar uma amostra primária para fazer a PCR, utiliza-se o produto de uma PCR anterior com um par de primers internos ao par utilizado na primeira reação. Ou seja, é a PCR do produto da PCR.

Essa variação da PCR é utilizada para aumentar a sensibilidade e especificidade nos casos em que as amostras utilizadas não são muito boas.

Na prática, fazemos a primeira reação e, quando ela fica pronta, transferimos poucos microlitros para um outro tubo e fazemos a segunda reação (nested).

Com isso, gastamos mais que o dobro do tempo para visualizar o resultado final no gel após a eletroforese.

Fonte: SHARON P. WILCZYNSKI, CHAPTER 7 - Molecular Biology, In Modern Surgical Pathology (Second Edition), Philadelphia, 2009, Pages 85-120.

Brunno Câmara Autor

Brunno Câmara - Biomédico, CRBM-GO 5596, habilitado em patologia clínica e hematologia. Docente do Ensino Superior. Especialista em Hematologia e Hemoterapia pelo programa de Residência Multiprofissional do Hospital das Clínicas - UFG (HC-UFG). Mestre em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro (área de concentração: virologia). Coordenador e docente do curso de pós-graduação em Hematologia e Hemoterapia da AGD Cursos. Criador e administrador do blog Biomedicina Padrão. Criador e integrante do podcast Biomedcast.

  • Compartilhar:

Artigos relacionados

1 comentários