Eletroforese convencional: conceito e técnica

Por Brunno Câmara - terça-feira, abril 30, 2019


Conceito e definição

Eletroforese refere-se à migração de partículas ou solutos eletricamente carregados em um meio líquido sob a influência de um campo elétrico.

A eletroforese de zona é a técnica mais comumente utilizada nas aplicações clínicas.
Nessa técnica, moléculas carregadas eletricamente migram como zonas, geralmente em um meio de suporte poroso, como o gel de agarose, após a amostra ter sido misturada com uma solução de tampão.


Um eletroferograma é gerado, que mostra as zonas das proteínas, cada uma nitidamente separada das zonas vizinhas, no material de suporte.

Essas zonas são visualizadas quando o meio de suporte é corado com corantes específicos para as proteínas. O meio é então seco e as zonas são quantificadas em um densitômetro.

Teoria da eletroforese

Num sistema de eletroforese, compostos químicos que ficam eletricamente carregados quando se tornam ionizados, movem-se em direção do cátodo (eletrodo negativo) ou do ânodo (eletrodo positivo), dependendo do tipo de carga que eles possuírem.

Íons positivos (cátions) migram em direção do cátodo e íons negativos (ânions) migram em direção do ânodo.



Um anfólito, molécula que é negativa e positivamente carregada, assume uma carga positiva em uma solução mais ácida do que seu ponto isoelétrico¹, e migra em direção do cátodo. Em uma solução mais alcalina, o anfólito é negativamente ionizado e migra em direção do ânodo.

Proteínas possuem muitos grupos amino (-NH2) e carboxila (-COOH) ionizáveis, então, numa solução elas comportam-se como anfólitos.

A taxa de migração é dependente de fatores como: a) carga elétrica da molécula em meio líquido; b) tamanho e forma da molécula; c) força do campo elétrico; d) propriedades do meio de suporte (gel); e) temperatura da operação.

¹ - o ponto isoelétrico de uma molécula é o pH em que ela não tem carga em meio líquido e não irá mover-se num campo elétrico.


Aparato necessário

A câmara de eletroforese é preenchida com solução tampão. Em cada lado dela há um eletrodo feito de platina ou carbono. O meio de suporte (gel) onde a separação ocorre fica em contato direto com o tampão. Todo o aparato é coberto para evitar evaporação e proteger o sistema; uma fonte de energia fornece a energia elétrica para a migração.


Solução tampão - serve como um componente multifuncional:

  • Carrega a corrente aplicada;
  • Estabelece o pH em que a eletroforese é realizada;
  • Determina a carga elétrica no soluto.

Meio de suporte - fornece a matriz em que a separação ocorrerá. Vários tipos de meios são usados na eletroforese. Os mais utilizados são os géis insolúveis, como acetato de celulose, agarose e poliacrilamida.

Géis são feitos numa solução do mesmo tampão que será utilizado na eletroforese e podem ser usados na posição vertical ou horizontal.

Gel de agarose - a agarose é uma fração neutra purificada de ágar. O gel é utilizado na separação de proteínas séricas, urinárias e do líquor; hemoglobinas variantes; isoenzimas; lipoproteínas; ácidos nucleicos e outras substâncias.


Gel de poliacrilamida - é um gel termoestável, transparente, durável e quimicamente inerte. Os poros são maiores, quando comparados com os do gel de agarose, o que permite que a maioria das proteínas séricas migrem sem impedimentos. Pode ser utilizado para separar ácidos nucleicos, inclusive fragmentos com tamanhos muitos próximos.

Procedimento geral

O procedimento geral de uma eletroforese convencional inclui:

  • Separação;
  • Coloração;
  • Detecção;
  • Quantificação.
SEPARAÇÃO

Um gel hidratado é colocado dentro da câmara. Ele não pode ter excesso de líquido nem presença de bolhas.

As amostras são pipetadas nos poços que foram feitos no gel, com pentes de vários tamanhos.


A eletroforese é conduzida por um determinado período de tempo sob condições de voltagem constante ou corrente constante.

COLORAÇÃO

Após a corrida eletroforética, para revelar (visualizar) o resultado, é necessário corar o gel com determinadas substâncias.

  • Proteínas séricas: Coomassie Brilliant Blue, amido black B;
  • Lipoproteínas: Sudan black, Sudan red;
  • DNA: Brometo de etídio;
  • Proteínas do líquor: Nitrato de prata.
É possível também corar proteínas específicas por meio da combinação de um corante com uma anti-globulina, como é feito na imunofixação.

DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

Após a etapa anterior, é possível quantificar cada uma das zonas como uma porcentagem do total ou como concentração absoluta por densitometria direta, se a concentração total da proteína for conhecida.

No densitômetro, o gel é colocado num sistema de medição ótica e a absorbância de cada fração é mostrada num dispositivo eletrônico.


Referência

Carl A. Burtis, David E. Bruns. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. W.B. Saunders Company; 7ª ed.

Brunno Câmara Autor

Brunno Câmara - Biomédico, CRBM-GO 5596, habilitado em patologia clínica e hematologia. Docente do Ensino Superior. Especialista em Hematologia e Hemoterapia pelo programa de Residência Multiprofissional do Hospital das Clínicas - UFG (HC-UFG). Mestre em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro (área de concentração: virologia). Coordenador e docente do curso de pós-graduação em Hematologia e Hemoterapia da AGD Cursos. Criador e administrador do blog Biomedicina Padrão. Criador e integrante do podcast Biomedcast.
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