Termociclador - convencional e em tempo real

Por Brunno Câmara - quinta-feira, abril 07, 2022


📚🔬 Cursos Biomedicina Padrão


O termociclador é um equipamento muito utilizado na biologia molecular como etapa importante da maioria das reações.

Como o próprio nome sugere, o aparelho varia a temperatura interna em ciclos (repetidas vezes).

Sua principal aplicação é na amplificação do DNA, como na reação em cadeira da polimerase (PCR).

Mas, ele também pode ser utilizado em outras reações que necessitam de alguma incubação em determinada temperatura ou variações de temperatura.

Um exemplo é a reação de digestão de fragmentos de ácidos nucleicos com enzimas de restrição. A transcrição reversa para produção do DNA complementar (cDNA) também utiliza o termociclador.

Bloco térmico

No termociclador, existe um bloco térmico com poços (orifícios) onde os microtubos são colocados.

Nos equipamentos modernos, o bloco pode ser de prata ou usar o elemento Peltier (arrefecimento termoelétrico).

Dependendo do equipamento e do seu objetivo, esse bloco térmico pode ficar todo na mesma temperatura ou produzir um gradiente de temperatura. 

Ou seja, cada fileira ou coluna do bloco térmico pode ser programada para ficar a uma determinada temperatura ao mesmo tempo.

Características gerais (marca dependentes)

Os blocos podem ter diferentes quantidades de poços para os tubos/placas, como 48 e 96 poços.

O volume recomendado de amostra por tubo geralmente varia entre 10 e 50 microlitros.

Geralmente, o termociclador pode variar a temperatura do bloco térmico entre 0 e 100ºC.

A velocidade de mudança de temperatura geralmente é de até 5ºC por segundo.

Variação de temperatura

A ciclagem é determinada pelo utilizador. 

Então, você programa quais temperaturas quer e por quanto tempo os tubos devem ficar em cada uma delas. 

Além disso, você deve configurar quantas vezes esse conjunto de temperaturas (ciclo) irá se repetir.

Numa PCR, como exemplo básico, um ciclo seria assim:

  • 95ºC por 30 segundos
  • 55ºC por 60 segundos
  • 72ºC por 60 segundos

Então, esse ciclo irá se repetir quantas vezes você determinar, como por exemplo 30 vezes.

Para não perder a reação ou ter que sair correndo para retirar os tubos do aparelho assim que terminar, geralmente acrescentamos ao final da ciclagem uma temperatura de 4ºC.

Assim, podemos pegar os tubos quando tivermos tempo. 

Muitas pessoas também colocam o termociclador para funcionar overnight (de um dia para o outro) e retiram os tubos quando chegam pela manhã.

Os equipamentos atuais permitem com que salvemos essas ciclagens e configurações para não ter que ficar configurando tudo do zero, todas as vezes que formos utilizá-los.

Inovações

Termocicladores para PCR em tempo real possuem sistemas óticos que permitem o monitoramento da fluorescência durante a reação de ciclagem.


Atualmente, a tampa do termociclador pode ser configurada para aquecer também. Isso previne a condensação de água nas tampas dos microtubos.

Alguns termocicladores são equipados com múltiplos blocos, permitindo que diferentes PCRs sejam feitas simultaneamente.

Um pouco de história

Os primeiros termocicladores eram manuais. 

Um dos equipamentos "modernos" da época era composto por três banhos-maria, cada um com uma temperatura fixa determinada.

Os tubos ficavam abertos, pois era necessário adicionar novas enzimas em cada ciclo, já que o aquecimento as degradavam.


Esses tubos eram movidos por uma pessoa, de um banho-maria para outro, ou por um braço robótico.

Tudo mudou depois que a enzima Taq polimerase foi identificada, uma DNA polimerase I isolada da bactéria Thermus aquaticus.

Por aguentar altas temperaturas sem desnaturar, sua utilização foi amplamente difundida e aplicada na PCR.

Links úteis

Diferença entre PCR e Nested PCR

BiomedExpress #7 - PCR

O que é e como fazer Clonagem Molecular

Aplicação da Biologia Molecular na Hematologia

Brunno Câmara Autor

Brunno Câmara - Biomédico, CRBM-GO 5596, habilitado em patologia clínica e hematologia. Docente do Ensino Superior. Especialista em Hematologia e Hemoterapia pelo programa de Residência Multiprofissional do Hospital das Clínicas - UFG (HC-UFG). Mestre em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro (área de concentração: virologia). Criador e administrador do blog Biomedicina Padrão. Criador e integrante do podcast Biomedcast.
| Contato: @biomedicinapadrao |