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Continue agora com a sua leitura do texto. Espero que goste.

Na clonagem molecular, moléculas de DNA recombinante são formadas in vitro por meio da inserção de fragmentos do DNA de interesse (chamado inserto) em vetores, como os plasmídeos.

Essas moléculas de DNA recombinante são, então, introduzidas nas células hospedeiras.
Quando elas replicam-se, produzem também uma enorme quantidade do DNA recombinante que contém a sequência de nucleotídios que você está estudando.

Plasmídeos

O vetor de clonagem mais utilizado são plasmídeos de Escherichia coli. Eles são moléculas de DNA circular compostas por regiões funcionais:

• Uma origem de replicação;
• Um gene de resistência a determinado antibiótico;
• Um gene LacZ (cor azul);
• Alguns sítios de restrição (região onde o inserto será inserido).

Ligação

Num tubo, enzimas de restrição (endonucleases de restrição) são colocadas em contato com os plasmídeos.

Elas irão clivar um sítio de restrição específico, abrindo os plasmídeos circulares, deixando as duas pontas livres para que o seu inserto seja inserido no plasmídeo e ele volte a ser circular.

Para que a sua sequência de interesse seja inserida dentro do plasmídeo, uma enzima deve ser utilizada: é a DNA ligase.

Ela irá formar ligações fosfodiéster entre o seu DNA e as duas extremidades dos plasmídeos.

Transformação

Após a ligação, o próximo passo é realizar a transformação.

Nessa etapa, o plasmídeo recombinante (com seu inserto) são inseridos em E. coli.

Para eles entrarem na célula, é necessário que sejam formados poros na membrana bacteriana.

Existem alguns modos de realizar a transformação, como por exemplo o choque térmico (mudanças de temperatura) e eletroporação (choque elétrico).

Semeadura e incubação

Após a transformação, as bactérias são semeadas em ágar contendo o antibiótico correspondente ao gene de resistência presente no plasmídeo.

Somente as bactérias que possuem o plasmídeo (contendo o gene de resistência) dentro delas conseguirão crescer no meio.

Ou seja, bactérias não transformadas (sem plasmídeos) não crescerão.

Nesse meio de cultura também é adicionado um substrato cromógeno, como por exemplo a X-Gal.

A X-Gal é um análogo da lactose, composto por uma galactose e um indol.

Lembra que falei que lá no plasmídeo também tem um gene chamado LacZ?

Então, ele codifica a enzima β-galactosidase que cliva a X-Gal em galactose e um composto azul escuro.

Triagem azul-branca

Para facilitar a visualização e saber se a ligação (plasmídeo + inserto) deu certo ou não, usamos essa mudança de cor nas colônias para fazer a triagem.

Dois tipos de colônias podem se formar:

Colônias brancas: bactérias em que os plasmídeos contendo o inserto estão presentes. Isso significa que o gene LacZ foi interrompido pelo inserto, não produziu a enzima e não clivou a X-gal. DEU CERTO!!!

Colônias azuis: bactérias que têm os plasmídeos, mas eles não tem o inserto. Isso significa que o gene LacZ não foi interrompido pelo inserto e foi transcrito na enzima e produziu a cor azul.

Então, numa placa, após a incubação, você verá esses dois tipos de colônias.



Seu objetivo é escolher as colônias brancas, pois são as que contêm sua sequência de DNA (provavelmente).

Como confirmar se o inserto realmente está no plasmídeo?

O próximo passo é selecionar algumas colônias brancas e semeá-las novamente, porém em meio líquido (caldo) e não em ágar.

Digamos que você selecionou seis colônias. Identifique seis tubos e, em cada um, inocule uma das colônias.

Após a incubação, você irá realizar a extração somente do DNA plasmidial, com protocolos específicos para esse tipo de extração.

Para confirmar se naquelas bactérias há mesmo o plasmídeo recombinante (inserto + plasmídeo), é necessário realizar uma reação com a enzima de restrição específica para separar seu inserto do plasmídeo.

Depois você faz uma eletroforese em gel de agarose e observa se o inserto está presente.

Se tiver dado certo, você verá duas bandas: uma do plasmídeo e outra do seu inserto.


Na imagem acima, mesmo que todas fossem brancas, somente as colônias 1, 3 e 4 possuíam o plasmídeo recombinante com seu inserto.

Às vezes será necessário testar várias colonias brancas para achar uma que deu certo.

Mesmo ela sendo branca, não significa 100% de certeza que terá seu inserto ligado nos plasmídeos.

O nome disso é Biologia Molecular. Só aceite e acredite!

O que fazer após a confirmação?

Com o DNA plasmidial extraído, e a certeza de que seu inserto está ligado a ele, você terá que purificá-lo.

Após isso, poderá usar em suas reações subsequentes, como uma PCR quantitativa.

Mas por que fazer clonagem molecular?

Por que essa técnica é capaz de gerar uma grande quantidade do seu DNA de interesse (inserto) em pouco tempo.

As bactérias são uma excelente e barata forma de multiplicar o DNA rapidamente.

Você teria que fazer centenas de PCRs para chegar na mesma quantidade de produto que uma clonagem molecular gera.

No meu mestrado, por exemplo, eu usei a clonagem molecular para elaborar uma curva padrão com o plasmídeo recombinante, e padronizar minha reação de PCR quantitativa para detectar e quantificar o DNA do Bocavírus Humano.

É possível também clonar um gene específico e fazer com que as bactérias expressem determinada proteína recombinante.

É utilizada também na avaliação da expressão gênica.

Referências

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman; 2000. Section 7.1, DNA Cloning with Plasmid Vectors.

Minha experiência prática no mestrado.