É assim que Anticorpos Neutralizantes são detectados

Por Brunno Câmara - terça-feira, junho 08, 2021


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Anticorpos neutralizantes (NAbs) são anticorpos (imunoglobulinas) que neutralizam qualquer efeito biológico que uma partícula infectante possa ter, deixando-a inativa.

Eles fazem parte da imunidade adaptativa humoral contra vírus, bactérias intracelulares e toxinas de micro-organismos.

Ao se ligar a estruturas de superfície do agente infeccioso, eles previnem que haja interação desse com as células do hospedeiro. Caso contrário, essas células seriam infectadas e destruídas.

Por exemplo, os NAbs produzidos na COVID-19 ligam-se no domínio RBD da proteína S (spike) do SARS-CoV-2. Isso faz com que o vírus não ligue-se ao seu receptor ECA2, impedindo a sua entrada na célula-alvo.

Porém, nem todos os anticorpos produzidos contra a proteína S do vírus são capazes de neutralizá-lo.

Anticorpos não neutralizantes

Nem todo anticorpo tem a capacidade de neutralizar um agente infeccioso, ou seja, impedir sua infectividade independente da presença de células imunes.

Mas, eles atuam de outras formas, como por exemplo opsonizando (marcando) o patógeno e/ou ativando o sistema complemento, com consequente ativação de células imunes como os fagócitos e linfócitos.

A diferença é que, aqui, os anticorpos ligam-se a outras regiões/proteínas do patógeno.


Detecção laboratorial de NAbs

Teste de neutralização de redução de placas (PRNT)

Considerado o padrão-ouro. Pode ser feito em placas de Petri ou microplacas (ex.: 96 poços/microneutralização).

Placas (de lise) são regiões na cultura de células em que é possível ver destruição celular causada pelo vírus.

A amostra de soro do paciente é diluída de forma seriada e misturada a uma quantidade determinada (constante) de partículas virais "vivas".

As misturas são então aplicadas em culturas de células em monocamada para a verificação dos títulos dos NAbs.


Para comparação, uma placa controle é feita sem a adição de NAbs na cultura de células (o vírus não é misturado com anticorpos).

A redução percentual do número de placas de lise é comparada com o controle. 

O cálculo consiste em determinar a diluição do soro que reduz em 50% ou 90% o número de placas de lise obtidas no controle viral, denominado PRNT50 e PRNT90, respectivamente.

Teste de neutralização com pseudovírus

Um vetor viral, por exemplo o VSV, é combinado com proteínas de membrana de outro vírus, dando origem a um pseudovírus. Geralmente, as partículas híbridas não possuem nenhum material genético.

Um exemplo de teste é o que usa um pseudovírus contendo uma molécula luminescente, como a luciferase, em seu interior.

O soro do paciente é adicionado numa cultura de células, por exemplo células HEK293T. Espera-se o período de incubação.

Quando os NAbs estão presentes no soro do paciente, o pseudovírus não liga-se ao receptor e a molécula luminescente não é detectada nas células da cultura. Ou seja, ausência de luminescência.

Quando os NAbs não estão presentes, a molécula luminescente entra nas células da cultura e ficam luminescentes. Ou seja, não haviam NAbs na amostra para neutralizar os pseudovírus.

Para (semi)quantificar os NAbs, é feita uma titulação com várias diluições do soro do paciente. Ou seja, várias culturas de células são testadas com diferentes diluições do soro do mesmo paciente.

O título do NAb é expresso como a maior diluição que neutralizou a dose teste do vírus.

ELISA

Para o SARS-CoV-2, existem também kits de ELISA em que a presença de NAbs é pesquisada.

Como já é sabido que na COVID-19 os NAbs são específicos para o domínio RBD da proteína S, esses imunoensaios podem detectar os anticorpos específicos para essa região.

Geralmente, os testes são qualitativos. Ou seja, detectam somente a presença ou ausência dos NAbs na amostra do paciente.

Em um kit de ELISA competitiva, por exemplo, utiliza-se ECA2 adsorvida na placa e o RBD marcado com peroxidase (HRP).

Sem os NAbs na amostra, ocorre interação entre RBD-HRP e ECA2. O resultado é o desenvolvimento de cor utilizando o substrato TMB (mais cor).

Porém, se presentes na amostra, os NAbs ligam-se ao RBD-HRP. Eles bloqueiam a interação entre RBD-HRP e ECA2 (competição).

A absorbância das amostras é inversamente proporcional à concentração de NAbs (quanto mais NAbs menor a absorbância/menos cor).

Referências

Alan L. Schmaljohn, “Protective Antiviral Antibodies that Lack Neutralizing Activity: Precedents and Evolution of Concepts”, Current HIV Research 2013; 11(5) . https://doi.org/10.2174/1570162X113116660057

Biomedicina Padrão. Resposta imunológica contra os vírus. 2020.

Klasse PJ. Neutralization of Virus Infectivity by Antibodies: Old Problems in New Perspectives. Adv Biol. 2014;2014:157895. doi:10.1155/2014/157895

Maeda A, Maeda J. Review of diagnostic plaque reduction neutralization tests for flavivirus infection. Vet J. 2013;195(1):33-40. doi:10.1016/j.tvjl.2012.08.019

Creative Diagnostics. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Assay Kit.

Brunno Câmara Autor

Brunno Câmara - Biomédico, CRBM-GO 5596, habilitado em patologia clínica e hematologia. Docente do Ensino Superior. Especialista em Hematologia e Hemoterapia pelo programa de Residência Multiprofissional do Hospital das Clínicas - UFG (HC-UFG). Mestre em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro (área de concentração: virologia). Criador e administrador do blog Biomedicina Padrão. Criador e integrante do podcast Biomedcast.
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